由Sun2抑制介导的核软化可延缓机械应力诱导的细胞衰老

　　在衰老过程或衰老相关疾病中，细胞或细胞骨架的力学性能会发生深刻变化，但细胞核力学性质和相关调控机制的潜在变化仍然知之甚少。核包膜（NE）和位于核包膜下方的层状网络是细胞核力学性能的关键决定因素。细胞将机械应力从细胞外基质（ECM）正确传递到细胞核的能力对于保护细胞核和基因组免受异常机械应力的损伤至关重要。细胞核上机械应力的增加至少通过两种机制促进细胞衰老：（1）作用在细胞核上的异常机械应力可能导致DNA损伤和基因组不稳定，这长期以来一直被认为是细胞衰老的主要致病因素；（2）核包膜结构和完整性的损伤增加可导致释放到细胞质中的核DNA（ncDNA）增加，从而导致先天免疫信号的过度激活和先天免疫相关的细胞衰老。

　　研究表明，来自ECM的机械应力通过定位于核膜上的 LINC（核骨架-细胞骨架连接物）复合物从细胞骨架传递到细胞核。细胞核通过LINC复合物紧密整合到细胞质的结构网络中。含有Sad1和UNC84结构域的蛋白质（Suns），主要是Sun1和Sun2，是LINC复合物的关键成分，也是将机械应力从细胞骨架传递到细胞核的关键介质。然而，目前Sun 蛋白对涉及DNA保护的核形态/结构或核内功能的潜在影响尚不清楚。

　　基于此，中国山东第一医科大学及美国斯蒂德曼·菲利蓬研究所、休斯顿德克萨斯大学健康科学中心麦戈文医学院的研究团队假设Sun蛋白可能在将机械应力传递到细胞核中发挥关键功能，并参与机械应力诱导的细胞衰老过程。核软化和核解耦是细胞抵抗机械应力诱导的核损伤的两种主要保护机制，他们推测Sun2表达的调节可能会潜在地改变早衰细胞中核软化和核解耦的状态，这与细胞抵抗机械应力诱导的核损伤和细胞衰老的能力有关。在最近的研究中，通过研究Zmpste24−/−（一种早衰小鼠模型）肌肉和间充质基质/干细胞（MSCs），进一步探索了机械应力下Sun2表达的潜在变化及其与早衰细胞核异常/损伤的相关性，以及抑制Sun2在调节机械应力诱导的核异常（即核起泡和DNA损伤）、核软化和核解耦的状态以及先天免疫激活相关的细胞衰老方面的潜在作用和机制。相关内容发表在 Cell Death Discovery 期刊题为“Nuclear softening mediated by Sun2 suppression delays mechanical stress-induced cellular senescence”。

　　首先，通过免疫荧光染色发现Z24−/− 小鼠肌肉中Sun2高表达的阳性细胞数量显著增加，而且大多位于胶原-I沉积增加的区域，这应该是老化肌肉中纤维化的ECM。众所周知，纤维化的ECM或组织的机械硬度通常高于正常ECM或组织，这可能表明Z24−/− 小鼠肌肉中纤维化区域的细胞通过产生更高的Sun2表达来适应ECM更僵硬的机械微环境。

　　为了进一步验证上述肌肉组织中观察到的ECM底物力学性能与Sun2表达之间的潜在相关性，从WT和Z24−/− 小鼠肌肉中分离MSCs，并在不同基质硬度（低：~50 kPa；高：~50,000 kPa）的平板中培养。结果表明，在更高的基质硬度中培养的细胞，Sun2的表达和F-actin的聚合明显增加（图1 A）。而且Z24−/− MSCs中带有核泡的细胞比例增加（图1 A、B），在核泡部分特异性存在较高水平的Sun2蛋白，而不是Sun1蛋白（图1 C）。Nesprin蛋白与LINC复合物中的Sun蛋白连接，并将该复合物与细胞质中的肌动蛋白细胞骨架物理连接。实验进一步观察到，Nesprin2和Sun2蛋白在核泡部分共定位（图1 C），表明核泡部分核膜处的LINC复合物主要含有Sun2（而不是Sun1），含有Sun2的LINC复合物可能对核泡的形成起作用。

　　图1 在较硬基质培养的MSCs中，Sun2蛋白表达和f -肌动蛋白聚合增加，且在核泡中富集。

　　作为机械响应性LINC复合物的关键成分，Sun2也可能对机械敏感。因此，接下来研究了外部机械应力对Z24−/− MSCs 中Sun2表达的潜在影响，通过细胞拉伸生物反应器在体外施加循环机械拉伸（10% 单轴循环拉伸，频率为0.5Hz）持续24小时。免疫荧光染色结果显示，RhoA GTP酶（F-肌动蛋白组装的关键调节因子）和F-actin聚合的激活明显增加，同时，Sun2蛋白的表达明显升高。这一结果表明，Z24−/− MSCs 在异常机械应力的刺激下，Sun2表达升高可能与RhoA激活和细胞骨架硬度的增加相结合。

　　由于Sun2表达升高与核起泡密切相关，因此继续研究了Sun2抑制对核泡形成的潜在影响。结果显示，抑制Sun2表达导致循环拉伸处理的Z24−/− MSCs 的核起泡水平降低（图2 A）。这一结果表明，抑制Sun2在拯救早衰细胞核免受极端机械应力损伤方面具有有益的作用。

　　此外，在循环拉伸处理的Z24−/− MSCs 中抑制Sun2表达导致γ-H2AX（DNA损伤指标）水平降低（图2 B），SASP（衰老相关分泌表型）因子、衰老标志物（p16和p21）和cGAS-Sting先天免疫信号效应因子（IFN-β和IFN-γ）的表达下调（图2 C），提示先天免疫相关细胞衰老的进展延迟。

　　图2 抑制Z24−/− MSCs中Sun2的表达可减少循环机械拉伸促进f -肌动蛋白聚合和核起泡。

　　随后，实验研究了在极端机械应力下降低Sun2表达导致核和DNA损伤减少的潜在细胞机制。核解耦，即细胞骨架与细胞核的解离，可以保护细胞核免受机械应力引起的损伤。图2 A 中拉伸下的Z24−/− MSCs中的F-actin聚合随着Sun2的抑制而减少，包括与核形状变化密切相关的核周位置的F-actin。这一结果表明，F-actin聚合的减少可能是由早衰细胞中Sun2抑制引起的核解耦的细胞机制的一部分。继续研究发现，抑制Sun2可能通过降低RhoA激活来促进核解耦，RhoA是F-actin细胞骨架的关键调节因子。然后通过调节RhoA活性，有效地改变了Sun2的表达，进一步验证了RhoA信号作为Sun2抑制机制的一部分参与减少机械应力诱导的核损伤。此外，还检查了核软化是否也可能是导致极端机械应力诱导的核和DNA损伤水平降低的Sun2表达减少的细胞机制的一部分。采用Bruker AFM探针对核硬度进行了测试（图3 A、B），发现机械拉伸后Z24−/−MSCs 的核硬度显著升高，而抑制Sun2可以有效降低循环机械拉伸引起的核硬度升高（图3 C、D）。

　　图3 抑制Z24−/−MSCs中Sun2的表达降低了循环机械拉伸引起的核硬度。

　　细胞核变形能力是细胞对机械力、细胞骨架组织和动力学、细胞极化和细胞迁移做出适当反应所必需的。核变形产生的核压缩可导致核膜破裂、DNA损伤和细胞凋亡增加。有趣的是，Sun2被发现可能参与调节正常细胞的核变形。最后，实验进一步研究了Z24−/− MSCs中Sun2的抑制是否能够挽救早衰细胞受损的核变形能力。结果表明，与WT MSCs相比，Z24−/− MSCs在通过Transwell的过滤器迁移后几乎无法存活，这表明Z24−/− MSCs的核变形能力受损导致核损伤和凋亡水平增加。然而，抑制Sun2可以有效地提高Z24−/− MSCs通过transwell过滤器的狭窄基质空间迁移后的存活率，这表明Sun2蛋白在调节早衰细胞的核变形能力方面可能具有关键作用。

　　图4 Sun2在年轻和衰老细胞中介导细胞核对机械应力的反应的潜在作用和机制的模型。

　　核骨架与细胞骨架（LINC）复合物的连接物将细胞核物理连接到细胞质。核层直接连接到内核膜上的Sun1和Sun2。Sun 蛋白穿透膜间隙，结合外核膜上与细胞骨架相连的蛋白。在机械应力较低的情况下，Sun1和Sun2在细胞核中的表达水平相对较低；而在机械应力较高的情况下，Sun2的表达明显升高。高Sun2表达可能伴随着肌动蛋白细胞骨架组装增加、RhoA活化、核硬度和核起泡，以及细胞衰老加速。研究结果还表明，抑制早衰细胞中的Sun2能够促进核解耦、细胞核软化并减少机械应力引起的核损伤，从而延缓细胞衰老的过程。

　　综上所述，该研究目前的结果表明，升高的Sun2表达在介导早衰细胞中机械应力诱导的核损伤中有很大关系，抑制Sun2表达可有效减少机械应力诱导的核损伤，这可能是治疗早衰衰老或衰老相关疾病的新型治疗策略。

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